摘要

尽管小细胞肺癌(SCLC)在分子和临床上具有异质性，但被视为一个单一实体，其被认为预后很差。利用肿瘤表达数据和非负矩阵分解，我们确定了四种SCLC亚型，主要由转录因子ASCL1、NEUROD1和POU2F3的差异表达或所有三种转录因子标记的低表达伴随炎症基因标记(分别为SCLC-A、N、P和I)定义。SCLC-I在化疗的基础上加用免疫疗法获益最大，而其他亚型各有不同的弱点，包括对PARP、Aurora激酶或bcl-2抑制剂的敏感性。顺铂治疗SCLC-A患者来源的异种移植瘤诱导肿瘤内向SCLC-I转移，支持亚型转换作为获得性铂耐药的机制。我们认为，将基线肿瘤亚型与治疗相匹配，以及操纵亚型开启治疗，可能会提高小细胞肺癌患者的反应深度和持续时间。

简介

结果

定义小细胞肺癌转录亚型

虽然转录SCLC肿瘤数据集很少，但我们在独立的队列中验证了这些亚型，包括来自23个SCLC肿瘤样本的RNA微阵列数据(图S1I)。然而，与数据集一样，这些肿瘤大多是LS-SCLC。为了确保没有亚型是仅限于早期患者的特征，我们使用来自参加3期IMpower试验的治疗-NA?患者的RNAseq来验证这些亚型(n=)。这项注册研究招募了确诊为延长存活期小细胞肺癌(ES-?)的NA患者，并随机接受卡铂/依托泊苷(EP)治疗，使用或不使用PD-L1抗体阿替利珠，并最终批准卡铂/依托泊苷/阿替利珠单抗(EP+ATEZO)作为ES-SCLC的标准治疗方案。使用应用于发现集的相同的NMF衍生基因签名，我们观察到由上述转录因子定义的四种亚型，以及其他分子特征，如NE分化、炎症基因和上皮-间充质转化(EMT)(图1F)。IMPower的亚型分布(SCLC-A51%，SCLC-N-23%，SCLC-I-18%，SCLC-P-7%)略有不同。最后，使用62个小细胞肺癌细胞系的RNAseq，我们确定了所有四个亚型的代表性细胞系模型(图S1J)，证实了在没有肿瘤微环境的情况下可以定义亚型。

图1.NMF从切除的SCLC肿瘤的NMF分析中确定了SCLC的四种转录亚型(A)同源相关性(A)。

(B-D)NMF选择的基因(B)，特别是ASCL1、NEUROD1和POU2F3(C)在4个簇上的差异表达。IHC分析患者SCLC肿瘤连续切片中ASCL1、NEUROD1和POU2F3的染色模式，例如显示四种亚型(D)中的每一种。

(E)条形图，显示在上述四种肿瘤(E)中，免疫组化检测ASCL1、NEUROD1和POU2F3阳性的肿瘤细胞核的百分比。

(F)将NMF衍生的基因签名应用于独立的ES-SCLC(IMpower)肿瘤数据集，揭示了四种SCLC亚型(F)。

样本大小：n=81个肿瘤(B，C)和n=个肿瘤(F)

定义转录亚型的特征

利用NE和非NE基因列表，我们观察到NE亚型(SCLC-A和-N)和非NE亚型(SCLC-P和-I)之间的明显区别(图2A)。例如，SCLC-A和-N在两个常见的NE标志物--嗜铬粒素A(ChgA)和突触素(Synaptophysin，SYP)(图2B和2C)的表达水平显著升高，而REST，一种NE基因的抑制因子，在SCLC-P和-I中都表现为更高的表达水平(图2D)。

虽然小细胞肺癌被认为是一种上皮恶性肿瘤，但EMT被认为是一种潜在的抗性机制。使用先前验证的EMT评分(其中更多的正值表示间充质分化)，SCLC-I是间质最多的(平均评分最高)，而SCLC-A是最上皮化的(平均评分最低)(图2E)。反相蛋白阵列(RPPA)数据支持这一结论，它量化了所有62个SCLC细胞系的多个总蛋白和磷酸化蛋白的表达，因为SCLC-I表达极低水平的上皮标志物E-cadherin(CDH1)，而表达高水平的间质标志物Vimentin(VIM)和Axl(图S2A-S2C)。使用IHC确定的每个亚型的代表性肿瘤(图S2D)，我们还比较了间充质标志物VIM和AXL的IHCH评分，发现它们在SCLC-I肿瘤中表达最高(图2F)。这些间质标志物可以作为确定SCLC-I的阳性、确证的肿瘤检测方法。

甲状腺转录因子1(TTF1)的表达在不同的小细胞肺癌肿瘤中是不同的，它的存在或不存在已被提出用来定义不同的小细胞肺癌亚群(Cardnell等人，年)。对SCLC细胞系的蛋白质组学分析表明，大多数TTF1阳性的SCLC模型属于SCLC-A亚型(图S2E)，与NKX2-1(编码TTF1的基因)一致，是ASCL1的已知转录靶点(Borromeo等人，年)。

全基因组测序工作显示，小细胞肺癌有很高的突变率，TP53和RB1几乎普遍存在有害突变(George等人，年)。虽然RPPA对p53的评估发现四种亚型的细胞系之间的表达没有差异(图S2F)，但在SCLC-I细胞系中RB1的蛋白表达略有增加(图S2G)，尽管小样本量排除了强有力的结论。然而，使用George等人()报告的SCLC中四个最常见缺失基因的肿瘤基因表达，比较发现各亚型之间没有明显的差异(图S2H)。这些研究人员还报道了几个共同扩增的基因(George等人，年)。虽然该拷贝数信息不可用，但我们使用这些基因的基因表达值作为拷贝数变异的替代(图S2I)。这些基因中的大多数在不同亚型之间的表达没有差异，除了MYC在SCLC-P亚型中的表达显著高于SCLC-P亚型外(图S2J)，表明MYC-扩增可能优先与SCLC-P相关。

图2.小细胞肺癌亚型(A-D)在每个亚型(A)的所有小细胞肺癌肿瘤中NE和非NE基因表达的分子和表型差异，包括NE标志物CHGA(B)和SYP(C)和REST(NE基因表达的转录抑制因子)的平均表达的比较。

(E)计算每个小细胞肺癌肿瘤的肺特异性EMT评分，并比较每个亚型(E)的平均EMT评分。

(F)对SCLC-A和SCLC-N，以及SCLC-I和SCLC-P的n=1个代表肿瘤进行免疫组化分析，检测波形蛋白(Vimentin，VIM)和Axl蛋白的表达，并与H评分(F)相关。样本量：N=81个肿瘤(A-E)。P值是单因素方差分析的结果。误差栏：±1.5倍四分位数范围(B-E)。

我们测试了这四种不同的亚型是否与特定的基因组改变有关。使用George等人建立的标准。为了功能意义,我们检查了四个亚型(图S2K-S2N)的突变情况,发现包括TP53和RB1在内的亚型之间的频率没有显著差异(George等人,年)。因此，从多个队列的基因组、转录组和蛋白质组数据的结合中,出现了每个亚型的表型图。SCLC-A是TTF1阳性小细胞肺癌的一种去甲肾上腺素上皮亚型。SCLC-N在去甲肾上腺素(NE)水平仍然较高的情况下,TTF1的表达基本缺失。同时,非NE向小细胞肺癌由SCLC-P和SCLC-I组成,根据EMT可进一步细分为SCLC-P和SCLC-I。

SCLC-I是一种新的炎症小细胞肺癌亚型。

在小细胞肺癌中，对免疫检查点阻断(ICB)的反应是罕见的，部分原因可能是免疫细胞，特别是细胞毒性T细胞的低渗透(Hamilton和Rath，年)。CD8A和CD8B在SCLC-I中的表达明显增高，提示有更多的细胞毒性T细胞浸润(图3A和3B)。为了全面评估免疫细胞的渗透，我们使用CIBERSORTx去卷积(Newman等人，年)利用基因表达来量化各种免疫群体。正如预期的那样，SCLC-I肿瘤具有最高的总免疫浸润(图3C)和细胞溶解活性(CYT)评分(图S3A)。虽然每个亚型都有相似的免疫细胞类型(图S3B)，但SCLC-I中几种免疫细胞群的绝对数量明显增加，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞(图3D)。其他已提出的小细胞肺癌ICB耐药机制包括HLA的低表达、干扰素信号和免疫检查点(Hamilton和Rath，年)。编码HLAs和其他抗原呈递机制的基因在George等人的SCLC-I肿瘤中的表达水平要高得多。()(图3E)。18基因干扰素相关T细胞基因表达谱(GEP)的表达(Ayers等人，年)，预测ICB在实体肿瘤中的应答，与肿瘤突变负荷(TMB)无关(Ott等人，年)，在SCLC-I肿瘤中一直较高(图3F)。虽然这些肿瘤无法获得完整的全基因组/外显子DNA测序数据来计算精确的TMB，但我们利用突变基因在总基因中的比例作为替代，并且观察到不同亚型之间的突变频率没有差异(图S3C)。SCLC-I肿瘤有无数免疫检查点分子的高表达，包括编码程序性死亡配体1(PD-L1)的CD和编码其受体程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的PDCD1(图S3D和S3E)。编码细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)配体的CD80和CD86以及CTLA4本身也是如此(图S3F-S3H)。其他在SCLC-I中高表达的靶向免疫检查点包括CD38、IDO1、TIGIT、C10orf54(Vista)、ICOS和LAG3(图S3I-S3N)。此外，干扰素基因刺激物(STING)诱导的T细胞吸引趋化因子CCL5和CXCL10在SCLC-I中表达更高，再次支持为ICB反应做好准备的炎症微环境(图S3O和S3P)(DellaCorte等人，年；Kitajima等人，年；Pantelidou等人，年；Parkes等人，年；Sen等人，年)。

图3.SCLC-I定义了小细胞肺癌的炎症亚型(A和B)，比较了CD8+T细胞标记物(A和B)的平均基因表达。

(C和D)CIBERSORTx分析总免疫浸润(C)和特定免疫细胞群(D)。

(E和F)比较George等人的亚型SCLC肿瘤中HLA和抗原提呈基因(E)的表达以及18基因-g相关T细胞基因表达谱(F)的热图。

(G)比较IMpower(G)肿瘤中18基因-g相关T细胞基因表达谱的热图。

(H-J)森林图，显示IMpower患者作为一个集体(所有肿瘤)和按亚型(H)的卡铂/依托泊苷+阿特唑珠单抗(EP+atezo)和EP+安慰剂组之间OS的HRs和中位数OS值(EP+ATEZO)和EP+安慰剂组之间的中位数OS值。在IMpower的EP+泰佐(I)和EP+安慰剂(J)组中，卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)在逐个亚型的基础上绘制了总体存活率曲线。

样本量：N=81个肿瘤(A-F)，个肿瘤(G)，名患者(泰佐组)和名患者(安慰剂组)(H-J)。

A-D的P值是单因素方差分析的结果。

误差栏：±1.5x四分位数范围(A-D)和±95%CI(H)

IMpower是第一个在SCLC中证明使用ICB改善PFS或OS的随机试验(Horn等人，年)。在这个队列中，我们再次观察到SCLC-iGroup限制的18基因T细胞GEP的强劲表达(图3G)。虽然IMpower试验没有统计上支持特定亚型亚群分析，但我们调查了生存趋势是否支持这样的假设，即SCLC-I肿瘤可能优先受益于ICB。当被划分为指定的亚型时(图1F)，OS风险比(HR)支持所有四种亚型中EP+Tatezo受益的趋势(图3H)，包括相对于其他三种亚型中的每一种，SCLC-I(图3I)相对于其他三种亚型中的每一种都有改善总体存活率的温和趋势(图3I)，这在EP+胎盘中没有观察到（图3J）。一项逐个亚型的分析比较了EP+ATEZO和EP+安慰剂组的存活率(图3H和S4A-S4D)，再次强调了跨亚型生存益处的趋势，尽管在SCLC-I中加入阿特唑珠单抗的中位数OS和获益幅度更大。我们发现，在EP+安慰剂组中，SCLC-I的中位数OS超过18个月，而在EP+安慰剂组中仅略高于10个月，后者与EP+安慰剂组中的SCLC-A和SCLC-N相当，表明SCLC-I不是一个预后标志物。与SCLC-I相比，在SCLC-A和-N中加入阿特唑珠单抗可使OS的中位数增加更多。SCLC-P的样本量很小，但在这一有限的集合中，SCLC-P似乎比每组中的其他三个亚型表现得特别差，尽管EP+Tatezo有改善的趋势。这些数据表明SCLC-P亚型同一性可能是一个不良的预后标志。正如预期的那样，我们观察到小细胞肺癌-I相对于所有其他肿瘤(HR=0.，95%CI：0.-0.)在EP+安慰剂组中有显著的OS益处，而不是EP+安慰剂组(图S4E和S4F)，这表明小细胞肺癌-I亚型的分配可能预示着ICB的益处。

为了调查其他亚型特定的脆弱性，我们利用了SCLC细胞系对多种药物的体外药物反应数据(Stewart等人，年；Lok等人，年；Murai等人，年；Pietanza等人，年)。值得注意的是，从我们自己和公开可获得的数据中观察到了SCLC-P的PARPI敏感性(GayCM等人，年；Polley等人，年)。虽然SCLC-P和SCLC-I细胞系模型的样本量较小，但出现了几个一致的发现。对于SCLC治疗标准的主干顺铂，我们观察到SCLC-P模型是最敏感的(p=0.06)，而SCLC-N，尤其是SCLC-I模型对顺铂具有耐药性，而SCLC-A模型表现出一系列的敏感性(图S5A)。

SCLC-P模型对这些数据集中测试的所有五种PARP抑制剂(PARPI)明显更敏感(图4A和S5B)。此外，SCLC-P亚型对包括抗叶酸和核苷类似物在内的抗代谢物一直是最敏感的(图4A)。以前的报告已经确定SLFN11的表达是小细胞肺癌PARPI和铂敏感性的关键预测因子(AllisonStewart等人，年；Lok等人，年；Murai等人，年；Pietanza等人，年)。值得注意的是，在SCLC-P亚组中观察到的PARPI敏感性伴随着SLFN11适度和不一致的表达，尽管对PARPI的反应是一致的。大多数SLFN11高表达的模型是SCLC-A(图S5C)。在SCLC-A中，存在SLFN11的双峰表达，如果将SLFN11的高表达和低表达分开，则对顺铂(图4B)和PARPIolaparib(图4C)的敏感性有显著差异。因此，除了ASCL1的二元考虑之外，可能还需要额外的二阶生物标记物分析来确定该亚型的进一步候选。

SCLC-N模型对多种极光激酶(AURK)抑制剂(AURKi)高度敏感(图4A和S5D)。CMYC蛋白表达是AURKi敏感性的预测生物标志物(Cardnell等人，年；Gay等人，年；Mollaoglu等人，年；Owanikoko等人，年)。因此，SCLC-N细胞株有很强的cMYC表达(图S5E)，尽管数据显示SCLC-P肿瘤有最高的MYC基因表达(图2G)。虽然这种差异在目前的模型下很难解释，但我们也观察到SCLC-P细胞系对AURKI同样敏感(图4A和S5D)。SCLC-A模型对多种B细胞淋巴瘤2(BCL2)抑制剂(BCL2i)敏感(图4A)。BCL2蛋白的表达与SCLC对BCL2i的敏感性有关(Cardnell等人，年；Gay等人，年；Lochmann等人，年)，许多BCL2蛋白表达最高的细胞株都属于SCLC-A亚型(图S5F)。此外，在我们的IHC分析中，我们一直观察到bcl2在SCLC-A肿瘤中的高表达(图4D)。

虽然我们预测ICBS在SCLC-I中将是最有效的，但由于缺乏代表SCLC-I的GEMM，这在体外甚至不容易在体内进行评估。有趣的是，另一个通常与免疫细胞相关的靶点，Bruton酪氨酸激酶(BTK)，在SCLC-I肿瘤中高度表达(图S5G)。因此，这一亚型对BTK抑制剂(BTKi)ibrutinib最敏感(图S5H)。BTKi已被批准用于几种血液系统恶性肿瘤，但在此之前并未作为小细胞肺癌的靶点进行研究。SCLC-I肿瘤的另一个潜在的靶向特征是EMT，尽管这是过去很大程度上没有得到治疗的一个特征。我们已经证明SCLC-I是这些亚型中间充质最多的亚型，并推测表观遗传修饰可能改变其EMT状态，使其更易于治疗。我们发现，研究中的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)莫西替诺坦能够降低Vimentin的表达，增加E-cadherin的表达，这与EMT逆转一致(图4e)。我们通过将这种人类细胞系(H)注射到小鼠的侧翼，建立了SCLC-I异种移植模型，并用莫西汀mg/kg/天或仅用赋形剂治疗肿瘤，发现在HDACi治疗的动物中肿瘤控制得到了改善(图4F)。

我们还假设SCLC亚型可能具有独特的细胞表面蛋白(即表面蛋白)的表达模式。在亚型特异性的基础上查询时，这些候选基因可能被发现，并可能被证明服从于基于免疫的治疗，包括嵌合抗原受体(CAR)和抗体-药物结合(ADC)策略。例如，抑制性Notch配体Delta-like配体3(DLL3)在小细胞肺癌中高表达，是ADCrovalPituzumabtesiine(Rova-T)的靶点，该药物在小细胞肺癌的II期临床试验中进行了评估。虽然试验只显示了适度的活性，但DLL3仍然是CART细胞和双特异性T细胞订购者(BITE)产品开发中的一个感兴趣的目标。我们观察到DLL3蛋白在SCLC-A肿瘤中表达较高，在SCLC-P和SCLC-I肿瘤中几乎不表达(图S5I)，而在三个转录数据集中，DLL3在SCLC-A中表达最高，在SCLC-P和SCLC-I中表达最低(图S5J-S5L)。为了更广泛地研究已知的细胞表面靶点，我们检查了编码治疗性单克隆抗体、CARS或ADC已知靶点的基因的表达(George等人，年；Sato等人，年；Stewart等人，a)。

生长抑素受体2(SSTR2)是生长抑素类似物(例如兰瑞肽)的成熟靶点，也是已经在为Net开发的ADCPEN-的靶点(Whalen等人，年；White等人，年)。虽然SSTR2并不是在所有的SCLC中广泛表达，但我们观察到在SCLC-N肿瘤和细胞系中都有高表达(图4G-4I)。流式细胞仪分析证实SSTR2蛋白在SCLC-N细胞系中表达，并支持在SCLC-N中相对表达量增加的趋势(图4J)。对于SCLC-P和SCLC-I，我们发现编码MHC-I类多肽相关序列A的基因MICA高表达(图S5m-S50o)。MICA是目前处于临床前开发阶段的一种分子(IPH43)的靶标(Bonnafous等人，年)。癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)是LabetuzumabGovernmentitecan(一种用于难治性转移性结直肠癌患者临床研究的ADC)和一种CART细胞(Das，；Dotan等人，；Sharkey等人，年；Thistlethwaite等人，)的靶标(Das，；Dotan等人，；Sharkey等人，；Thistlethwaite等人，)。虽然这个分子在SCLC中不是一个确定的靶点，但我们观察到CEACAM5在SCLC-A中的表达显著增加(图S5P-S5R)。

我们的NMF分析提供了患者的基本临床数据(George等人，年)。无复发生存率(图S5S)和OS(图S5T)无显著差异。人口统计学信息（如确诊时的年龄(图S5U)、平均总吸烟年限(图S5V)和性别(图S5W)）在各组之间也没有显著差异。这些肿瘤大部分来自接受手术切除的LS-SCLC（局限期）患者，极少数来自ES-SCLC（广泛期）患者。由于偏向于非常早期的疾病，生存率超过了小细胞肺癌(Byers和Rudin，)。少数ES-SCLC患者在SCLC-A和SCLC-N亚型之间，但在非限制期状态的频率上没有显著差异(图S5X)。

先前的分析主要集中在小细胞肺癌亚型间的异质性。然而，这些数据集缺乏辨别亚型肿瘤内异质性是否存在的分辨率。IHC分析揭示了主要代表单一亚型的肿瘤实例(图1D和1E；表S2)。然而，即使是这些肿瘤也有少量表达其他转录因子的细胞。其他人也对ITH提出了类似的意见(Simpson等人，年)。在极少数情况下，肿瘤看起来确实是混合的，在单个肿瘤中存在多种亚型，比例相当大--以肿瘤#5为例，其中ASCL1和NEUROD1表达细胞位于空间上不同的区域(图5A)。因此，ITH亚型可以存在，这增加了这些亚型可能代表一种谱系或连续体的可能性，而ITH亚型可能是小细胞肺癌自然历史的基础。事实上，最近使用SCLCGEMM的研究表明，单个肿瘤细胞经历了从一种转录因子定义的亚型到另一种转录因子亚型的时间进化(爱尔兰等人，年)。

我们从小细胞肺癌患者(Stewart等人，b)中推导出一系列CDX模型，包括等待/接受一线治疗的患者和疾病复发的患者。这些模型已经过广泛验证，可以确保重现原始患者的分子和临床反应特征(Stewart等人，b)。这些模型中的肿瘤被分离成单细胞悬液，并接受10x基因组学scRNAseq，随后的筛选步骤为每个模型选择0个细胞(Stewart等人，b)。

基于ASCL1、NEUROD1和POU2F3的单细胞表达，我们在我们的异种移植文库中发现了SCLC-A和SCLC-N两种主要模式(表S3)。T分布随机邻居嵌入(t-SNE)特征图显示了ASCL1和NEUROD1的单细胞表达的存在或不存在，以及被认为是三重负的细胞(如在SCLC-I中)。这些图表强调，即使在ASCL1占优势(图5B)或NeUROD1占优势(图5C)的异种移植瘤中，也有适度的ITH亚型。

ScRNAseq还允许探索亚型定义转录因子的共表达。根据ASCL1、NEUROD1和POU2F3表达(和共表达)的二元存在/不存在，每个细胞可以被分类为七种类型中的一种(表S3)。虽然大多数细胞只表达其中一种转录因子，但这种表达并不是完全互斥的。虽然在任何模型中只有不到1%的细胞表达POU2F3，但这些罕见的POU2F3阳性细胞都表现出ASCL1的共同表达。此外，在MDASC39中，近10%的细胞同时表达ASCL1和NEUROD1，尽管在其他肿瘤中这一比例要低得多。虽然我们在批量分析中发现ASCL1和NEUROD1有时可能在同一肿瘤中共表达(图1C中的例子)，并且这可能以互斥的模式出现(如图5A)，但这些数据表明这种共表达可以在单细胞水平上发生。

我们认为，表观遗传调控可能控制着从ASCL1到NEUROD1的表达连续体，共表达代表一种过渡状态。根据基因表达情况，我们将SCLC细胞系分为仅ASCL1、仅NEUROD1或两者兼而有之。使用公开的甲基化数据，我们观察到这三种分类可以通过NEUROD1转录起始位点(TSS)上游区域的甲基化β值来区分(图5D、S6A和S6B)。具体地说，仅ASCL1的细胞株在NEUROD1TSS的近端和更远端都有相对较高的甲基化，而只有NEUROD1的细胞株几乎没有近端的甲基化，而更远端的位点几乎没有甲基化。分类为‘’两者‘’的细胞系表现出近端位点的低甲基化，但更远端位点的甲基化程度几乎与仅有ASCL1的细胞系一样高。正如预测的那样，操纵表观遗传机制可以调节NEUROD1的表达，在一定程度上也可以调节ASCL1的表达。我们选择了7个小细胞肺癌-A细胞株，这些细胞株在基线水平上NEUROD1的表达很低或检测不到，但ASCL1的表达很强。用赖氨酸特异性的组蛋白去甲基化酶1A(LSD1i)抑制剂处理后，NEUROD1的表达变化不大(图5e)。然而，用DNA甲基转移酶1(DNMT1i)抑制剂地西他滨治疗后，NEUROD1的表达显著、一致地上调(图5e)，包括在基线水平没有检测到NEUROD1表达的两个细胞系(数据未显示)。同时，LSD1i和DNTM1i治疗都能适度、可比地下调ASCL1(图5F)。总之，这些数据表明表观遗传机制可能调节SCLC-A和SCLC-N模型之间的区别。

图4.SCLC亚型具有独特的治疗脆弱性

(A)PARP抑制剂、核苷类似物、抗叶酸、AURK抑制剂和BCL2抑制剂的每个SCLC细胞亚型的体外平均相对IC50值的比较(A)。

(B和C)比较SLFN11高表达和低表达的SCLC-A细胞株中顺铂(B)和PARPI-olaparib(C)的IC50值。(D)对代表每个亚型的肿瘤(SCLC-A和SCLC-N的代表性图像；SCLC-P和SCLC-I的n=1)进行bcl2表达的免疫组化分析，并注明相关的H分数(D)。

(E)Westernblot显示，在加入TGFb(EMT诱导剂)和莫西替坦(E)的情况下，H-细胞中E-cadherin和Vimentin的表达。

(F)小鼠H侧翼细胞株移植瘤生长曲线，用赋形剂或莫西替坦处理(F)。(G-J)细胞表面蛋白编码基因SSTR2在多个数据集(G-I)中的平均表达，以及亚型细胞系(J)中表达SSTR2蛋白的分析细胞比例的流式细胞术分析。样本大小：n=62个细胞系(A，H)，n=38个细胞系(B-C)，n=8个小鼠肿瘤/治疗臂(G)，n=23个肿瘤(I)，n=18个细胞系(J)。P值为单因素双侧t检验(B-C)或单因素方差分析(A，G-J)的结果。

误差栏：±1.5x四分位数范围(B、C、G-J)或±SEM(F)。

图5.肿瘤和肿瘤衍生模型中小细胞肺癌亚型的瘤内异质性

(A)异质性肿瘤中ASCL1和NEUROD1的IHC表达模式(A)。

(B和C)在代表SCLC-A(MDA-SC16)(B)和SCLC-N(MDA-SC49)(C)亚型的CDX模型中，ASCL1、NEUROD1和ASCL1/NEUROD1/POU2F3(SCLC-I；三重阴性)缺失的SCRNAseq的t-SNE特征图。

(D)热图突出显示在仅表达ASCL1、仅表达NEUROD1或两者都表达的细胞系(D)中，NEUROD1启动子在转录起始点(分别为TSS1和TSS)远端和近端的差异甲基化(β值)。

(E-G)经LSD1i和DNMT1i处理的SCLC-A细胞株中NEUROD1(E)和ASCL1(F)的相对表达。SCLC-I(三阴性)细胞在复发SCLC患者(复发)和从未治疗/当前一线治疗(一线)患者(一线)CDX中的平均比例比较(G)。(G)SCLC-I(三阴性)细胞在复发SCLC患者(复发)和从未治疗/当前一线治疗患者(一线)的CDX中的平均比例比较(G)。样本大小：n=0个细胞(B-C)，n=28个细胞系(D)，n=5个细胞系(E)，n=10个肿瘤(G)。P值是Wilcoxon秩和检验(E，F)或双尾t检验(G)的结果。误差栏：±1.5x四分位数范围(E，F)或±SEM(G)。

SCLC-I群体的出现伴随着铂抗性

在我们的scRNAseq数据中，我们注意到铂复发模型中三重负(即SCLC-I)细胞增加(表S3；图5G)。由于SCLC-I代表对铂高度耐药的亚型，我们推测，肿瘤内向增加SCLC-I的转变可能是铂耐药的基础。我们选择了两个铂敏感的、ASCL1占优势的CDX模型(MDASC53和MDASC68)，这些模型是从治疗非?患者发展而来的。这些模型接受顺铂治疗，达到最大反应，然后在整个复发过程中(“顺式复发”)，并与相同大小的匹配载体治疗的肿瘤(“治疗-NA?¨ve”)一起收集scRNAseq(图S7A和(Stewart等人，b))。使用t-SNE特征图，我们比较了亲代治疗-NA?ve模型和顺式复发模型中ASCL1表达的存在与否，在这两种情况下，我们都观察到ASCL1阳性细胞比例的减少(图6A和6B)，并出现了明显的“岛”簇(用矩形突出显示，图6A和6B)。在这两种情况下，这一簇包含了复发后出现的大多数ASCL1阴性细胞。更仔细地观察这一簇(图6C和6D)，突出显示ASCL1阴性细胞没有获得NEUROD1、POU2F3甚至YAP1的表达(图S7B和S7C)。相反，我们发现这一簇包含的细胞基本上是三重负的(SCLC-I)(图S7D和S7E)，并且具有更多的间质EMT评分(图6E和6F)-这也是SCLC-I细胞的典型特征。此外，尽管来自治疗-NA?ve模型的细胞几乎普遍为阴性，正如预期的小细胞肺癌-A细胞一样，那些来自顺式复发模型的细胞持续获得MHC-II类基因的表达，包括HLA-DRB1和HLA-DQA1(图6C，6D，和S7F-S7I)，但仅在小细胞肺癌-I岛群内的细胞中表达。

先前的研究已经提出，Notch激活能够介导NE和非NESCLC细胞命运之间的转换(爱尔兰等人，年；Lim等人，年)，类似于在SCLC-A到SCLC-I中观察到的结果。我们比较了Notch通路转录靶标HES1在治疗-NA?？Ve和顺式复发对中的表达。在MDA-SC53中，我们看到复发后HES1的表达略有增加，这表明Notch被激活，仅限于SCLC-I细胞聚集的区域(图S7D；8A)。而在MDA-SC68中，HES1的表达在复发后略有降低，尽管SCLC-I簇保持了显著的HES1表达(图S7E；8B)。Notch抑制配体和假定的SCLC靶标DLL3正好相反，正如预期的那样，降低Notch激活的分子。在MDA-SC53和MDA-SC68中，DLL3在SCLC-I簇中基本上不表达(图S8C和S8D)，尽管总体DLL3在MDA-SC53复发后略有增加，而在MDA-SC68中显著降低。Notch靶标和抑制剂的这些波动与先前的数据一致，强调了Notch信号在SCLC表型转换中的作用。虽然最近的一项研究发现MYC激活是这一过程的关键启动者，但我们的模型显示，在SCLC-I介导的区域中，MYC、MYCL或MYCN的表达最低(图S8E和S8F；数据未显示)。

尚不清楚顺铂复发后出现的小群SCLC-I细胞是否足以驱动观察到的铂耐药。两个假设解释了观察到的亚型转换可能驱动全球阻力的方式。第一个假设表明，这里使用的单细胞亚型二元评估的局限性低估了亚型进化的水平。在MDA-SC68和MDA-SC53中，我们看到铂耐药后ASCL1的表达水平在全球范围内降低(图6G和S8G)。这种减少不仅仅是由于那些现在ASCL1为空的细胞，正如只使用那些保留了一些ASCL1表达的细胞进行的类似分析所说明的那样(图6H和S8H)。在这两种情况下，即使仅限于ASCL1阳性细胞，顺铂复发后EMT评分也显著增加(图S8I和S8J)。综上所述，这些数据表明，即使在现在包含完全三重阴性细胞的SCLC-I簇之外，也存在朝着降低ASCL1表达和增加SCLC-I功能(例如，EMT)的持续进化，这可能是导致铂敏感性降低的原因。

图6.在SCLC-A主要异种移植模型中，SCLC-I群体的出现与顺铂耐药相吻合。

(A和B)t-SNE特征图比较了亲代、治疗-NA?ve和顺铂耐药/复发(顺铂复发)CDX模型(MDASC53，A；MDA-SC68，B)。

(C和D)A和B的高亮部分显示明显的簇，ASCL1丢失显著(C，D)。

(E和F)该区域的细胞现在呈三重阴性(SCLC-I)，EMT评分高(E，F)。

(G和H)小提琴曲线图比较ASCL1在所有细胞(G)和仅ASCL1阳性细胞(H)中的表达，比较丙二醛-SC68治疗-NA?VE和顺铂复发的异种移植瘤(G)之间的ASCL1表达。

样本量：N=每臂0个细胞(A-H)。P值是双尾t检验(G，H)的结果。

一个其次的互补性假设是，在铂耐药后出现的SCLC-I细胞可能是一个高度耐药、高度可塑性(即干细胞样)的群体，即使仍然对铂敏感的细胞经历细胞死亡，也有可能补充肿瘤。为了解决这个问题，我们探索了使用RNA速度来定量测量单细胞可塑性的方法。首先，我们将t-SNE和聚类算法应用于来自顺铂-NA??和顺铂复发肿瘤的混合细胞(图7A、7B、S9A和S9B)。在每种情况下，我们再次确定了非NE岛，类似于图6，这里几乎完全由复发细胞组成，显示缺少ASCL1和存在SCLC-I特征(例如，ZEB2，EMT的转录调节因子)(图7C、7D、S9C和S9D)。在MDA-SC68的岛簇之外，敏感和抗性细胞通常聚集在一起(簇3、6和7)，但抗性模型中的很大一部分细胞转移到表型空间的相邻区域(簇4、5和8)。核糖核酸速度显示，顺铂-NA??和顺铂复发的样本都表现出正的速度趋势，趋向于簇4，使其成为表型景观中的一个下沉(图7E-7H)。第9-10簇中的群体富含抗性细胞和SCLC-I标记。虽然SCLC-I群集中细胞的速度矢量长度很重要，但这些细胞的运动方向不太清楚。因此，我们使用了基于分区的图形抽象(Paga)来进一步研究这一运动。PAGA是一种计算工具，它将聚类与从RNA速度推断的连续细胞转变协调起来。如PAGA图(图7F和7H)所示，抗性样本中的SCLC-I簇能够过渡到主要群体中的簇5。这表明，在动态平衡下，SCLC-I细胞作为一个源，通过第5簇向抗性汇簇4过渡，这两个簇都富含复发的细胞。在MDA-SC53中也观察到了类似的动态，这一次是从第7、9和10簇观察到的，这些簇代表了具有SCLC-I特征的大量复发细胞的岛群。正如在MDA-SC68中一样，速度流和PagA图表明，这些细胞可以作用于补充第1、4和6簇中的那些细胞，这些细胞为耐药细胞而富集(图S9E-S9H)。

这些观察表明，每个模型中的SCLC-I簇都是高度可塑性的，可能会导致更多增殖的SCLC种群。为了测试这种可能性，我们使用RNA速度来推导出一个度量来表征单个细胞的可塑性。从景观势的理论概念引出，我们称之为度量细胞传输势(CTrP)。简而言之，CTrP是每个细胞可能通过表型空间的平均距离，为每个细胞计算的距离之和是到其他每个细胞的距离之和，加权的是马尔可夫链模型导出的在每个细胞状态中被发现的概率(参见STAR方法)。因为CTrP度量是一个距离，所以它可以跨样本进行比较，从而使我们能够比较SCLC-I细胞与其他耐药细胞和敏感细胞的可塑性。由复发的SCLC-I细胞组成的岛群具有明显更高的CTrP，因此具有可塑性(图7I、7J、S9I和S9J)。此外，与敏感肿瘤相比，耐药肿瘤显示出几乎普遍的可塑性增加，因此SCLC-I细胞是最具可塑性的表型，无论治疗方法如何(图7K和S19K)。这表明可塑性可能是耐药SCLC-I细胞的一个决定性特征。

我们还考虑了更高的增殖或更低的死亡率是否可以解释SCLC-I作为祖细胞和治疗耐药细胞的来源。SCLC-I细胞在细胞周期(S或G2M)基因上没有显著上调，也没有显著下调细胞死亡标志物(图S9L-S9O)。事实上，给每个细胞分配一个时相表明，大多数SCLC-I细胞处于静止状态，G1基因增加，可能会轻微上调死亡标志物。因此，SCLC-I细胞似乎既不比其他细胞更具增殖能力，也不比其他细胞更不容易死亡。

综上所述，这些单细胞分析表明顺铂耐药与代表SCLC-I亚型的一群细胞的出现是一致的，这些细胞显然来源于最初的SCLC-A细胞，这些细胞经历了与Notch通路激活波动相关的亚型转换。反过来，这些SCLC-I细胞具有干细胞样的特征(例如可塑性)，这可能是少数群体驱动耐药肿瘤表型的能力的基础。

图7.新出现的SCLC-I群体通过转录可塑性

(A-D)t-SNE投影所有来自MDA-SC68CDX的细胞支持肿瘤范围的耐药性，治疗历史(A)或莱顿聚类分配(B)表示。ASCL1(C)和ZEB2(D)在这些细胞中的表达。

(E-H)注意右上角，主要由顺铂复发的细胞组成，显示较低的ASCL1表达，而岛群实质上是ASCL1缺失。顺铂-NA?¨ve(E-F)和顺铂复发(G-H)CDX肿瘤细胞的核糖核酸速度矢量流和PAGA图。

(I和J)细胞可塑性，通过细胞转运潜力来衡量，来自顺铂-NA?¨ve(I)和顺铂复发(J)肿瘤的细胞突出显示复发肿瘤内岛群中可塑性最大的区域。

(K)比较顺铂-NA?¨ve和复发细胞(K)之间的转运潜力，显示顺铂复发细胞的整体可塑性较高。

样本量：n=每臂0个细胞。

讨论

小细胞肺癌已被证明是个人化治疗时代的一个挑战，至少部分是由于低估了肿瘤间和瘤内的异质性。由于频率增加，由ASCL1和NEUROD1驱动的高度NE小细胞肺癌以及cMYC和TTF1表达等相关因素主导了先前描述小细胞肺癌肿瘤间异质性的努力(Cardnell等人，年；Carney等人，；Gazdar等人，；Zhang等人，年)。最近发现了一种由POU2F3驱动的非NE簇状细胞SCLC变体(Huang等人，年)，这促使对SCLC分类的重新评估(Rudin等人，年)。虽然非NESCLC大多被描述为单一亚型(Zhang等人，年)，但我们观察到了两个独特的非NE分子亚型SCLC(SCLC-I和SCLC-P)。SCLC-I表现为EMT和炎症表型，与HLAs、干扰素-g激活和免疫检查点相关的基因高表达，与EMT和免疫相关基因表达之间的关联一致(Mak等人，年)。值得注意的是，SCLC-I并不是由YAP1表达专门定义的，这一分类有别于其他地方提出的分类(Rudin等人，年)，并且与随后的IHC分析一致，该分析未能识别出不同的SCLC-Y群体(Baine等人，年)。虽然SCLC-I的部分定义是由其炎症特征决定的，但它也在缺乏肿瘤免疫微环境的系统中被鉴定，这表明肿瘤内在和外部信号可能都是这一亚型的生物学和独特的治疗脆弱性的基础。

这种亚型分类的临床意义重大，因为每种亚型都表现出对研究疗法的独特易感性。例如，以PARP抑制剂为例，SLFN11的高表达是目前流行的预测生物标记物(AllisonStewart等人，年；Pietanza等人，年)。似乎POU2F3表达的肿瘤可能捕获了一个独特的，主要是SLFN11不依赖的队列，该队列也对PARPI敏感。事实上，最近的一项研究在一项小鼠联合临床试验中用PARPiolaparib(加替莫唑胺)治疗患者来源的异种移植物，发现单独的SCLC-P模型进展时间最长(Farago等人，年)。然而，许多体外观察都需要临床验证。考虑到bcl-2抑制剂在未选择的小细胞肺癌患者群体中令人失望的疗效(Paik等人，年；Rudin等人，年)，基于SCLC-A的流行率，我们可以预测更大的益处。在这些试验中，BCL2抑制剂仅在复发患者中进行了评估，这可能突出了铂治疗后亚型演变对生物标记物表达的影响。

虽然ICB现在是小细胞肺癌治疗的标准，但这一治疗类别的预测生物标志物仍然难以捉摸，有证据支持(和反对)TMB和PD-L1的表达(Chung等人，年；Hellmann等人，年)。在George等人和IMpower数据集中，SCLC-I分别占所有肿瘤的17%和18.5%，与Checkmate(Antonia等人，年)和Keynote-(Chung等人)在复发SCLC中观察到的ipilimumab/nivolumab(19-23%)和单药pembrolizumab(19%)的应答率相当。我们对IMpower数据的亚型分析支持ICBS在SCLC-I中特别有效的假设，同时仍然支持IMpower方案的使用，而不考虑亚型。诚然，这些分析是计划外的和有追溯性的，因此，在解释这些分析时应该牢记这些警告。单细胞分析显示，亚型特异性ITH可能是一个动态过程，因为铂治疗增加了更多的化疗耐药三阴性(SCLC-I)细胞。

为了支持亚型转换作为潜在的机制，所分析的两个模型之一(MDA-SC68)基本上没有预先存在的SCLC-I细胞，因为少数三重阴性的细胞缺乏SCLC-I的其他特征，而可能是通过scRNAseq反映基因丢失。另一方面，复发后出现的那些三重阴性细胞显示出一致的、强大的SCLC-I特征，我们观察到有证据表明，即使在ASCL1阳性的细胞中，转录也从SCLC-A转向SCLC-I。此外，来自对转基因生物的scRNAseq分析的最新证据表明，随着发育时间的推移，亚型和表型得到进化(爱尔兰等人，年；Lim等人，年)。其他人展示了在SCLC-A细胞系培养中自发出现间充质发炎的后代(Canadas等人，年；Krohn等人，年)。然而，我们的数据将这种转换现象与治疗，特别是铂耐药联系在一起，这与SCLC-I细胞在体外明显对铂耐药的事实一致。具有多种亚型特征的少量细胞群的存在可能突出处于亚型间过渡的细胞或具有可塑性的细胞采用多种亚型。下游的scRNAseq分析也强调了即使是一小部分高度可塑性的SCLC-I细胞的潜在影响。因此，根据我们的分析，针对或限制这种治疗诱导的SCLC-I细胞群体是至关重要的，因为我们的分析表明这一群体具有干细胞样特征。

大多数被分析的SCLC肿瘤和模型很容易被分为四种亚型之一，这使得在一项单一伞形试验中进行前瞻性分型的现实情况成为可能，即根据患者的SCLC亚型，患者被分配到治疗组(例如，SCLC-I联合ICB，SCLC-P联合PARP抑制剂)。亚型可以通过转录、蛋白质组甚至表观遗传学分类来确定，然后进行动态监测。如果这些预测中的任何一个显示出显著的益处，它将代表着小细胞肺癌的第一个标准护理分子生物标记物的选择，并向这种毁灭性疾病的个性化治疗迈出了基础性的一步。

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