KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince

概述

OVERVIEW

INTERNATIONALJOURNALOFMOLECULARSCIENCES(IF=4.)上刊载了西班牙马德里康普鲁坦斯大学生物学院生物化学和分子生物学系JesúsPérez-Gil研究团队（E-mail：jperezgil

前言TNTRODUCTION

肺呼吸的基本功能是通过空气和血液之间的气体交换来实现的。为了实现这一点，形成了一种完美的结构，其中肺泡构成了肺系统的功能单元。在肺泡中，需要一个薄的交换表面结构来确保氧向毛细血管的有效扩散，这是通过构成总肺泡面积95%的扁平肺泡上皮ⅰ型细胞(AE1C)的存在来实现的。另一方面，空气-水界面的存在在物理上要求降低液体分子间的内聚力产生的表面张力，否则会导致肺泡收缩。为了发挥这一关键作用，肺泡ⅱ型上皮细胞(AE2C)分泌肺表面活性物质，这是一种脂质-蛋白质复合物，在呼吸界面形成表面活性膜，使其稳定并避免呼气期间肺泡塌陷。此外，除了这一主要功能之外，暴露于外部潜在有害颗粒和微生物的巨大呼吸面积，使肺在抵御病原体方面发挥着重要作用，肺泡巨噬细胞(AM)以及表面活性剂构成的第一道防线。

肺表面活性物质主要由脂质组成(约90%质量)，磷脂构成主要类别，磷脂酰胆碱为主要种类(70-80%)。其中，饱和的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)平均占40%(尽管它在人、猪、大鼠或小鼠中可能高达表面活性剂质量的50-55%)，而不饱和的PC和阴离子磷脂如磷脂酰甘油(PG，8%)和磷脂酰肌醇(PI)也是重要成分。表面活性剂还含有中性脂质，如胆固醇，约占重量的5-8%。其他含量较低的磷脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰丝氨酸，以及微量的甘油三酯和脂肪酸。除了脂质，表面活性剂还含有蛋白质(约10%)，这些表面活性剂特异性蛋白质(6-8%)在维持系统的正常结构和功能中起着重要作用。SP-B和SP-C是小的高度疏水的阳离子蛋白质，需要它们来实现最佳的表面活性剂生物物理特性，即呼吸动力学过程中界面膜的形成和稳定。另一方面，亲水性蛋白质SP-A和SP-D属于聚集蛋白(含C型胶原的凝集素)家族，其特征在于其识别和结合病原体的能力，为这些蛋白质提供了与肺防御相关的作用。

表面活性剂脂质和蛋白质在AE2C中合成，并组装成高度密集的膜状细胞器，称为板层体(LB)，然后分泌到排列在肺泡空间的薄液相中。表面活性剂膜迅速吸附在气液界面上，形成功能膜，该功能膜能够在呼气时表面积减少时实现最小的表面张力值，并允许在吸气时肺泡扩张期间有效地重新吸入物质。表面活性剂复合物的组成和结构负责提供其稳定和动态性质，因此某些脂质和蛋白质(主要是SP-B和SP-C)的存在以及表面相关的多层储层的形成对于表面活性剂发挥功能至关重要。

方法METHOD

当层状体从AE2C分泌到肺泡时，表面活性剂解包并迅速吸附到气液界面，形成表面活性膜(图1)。这种基本能力，加上肺泡压缩过程中表面张力降低到非常低的值，以及吸气过程中物质的有效再伸展，是表面活性剂有效的生物物理功能所严格要求的，并依赖于其特殊的脂质-蛋白质组成。主表面活性剂磷脂DPPC的饱和酰基链对于在呼气时表面积减少时界面膜的最大填充是必不可少的，从而将表面张力降低到极低的值。然而，DPPC不能通过自身有效地吸附到空气-水界面，因此阴离子和不饱和磷脂，连同表面活性剂蛋白质，在该过程中起重要作用。一旦表面膜的大部分流体区域被迫折叠，这些表面活性剂组分也是生成表面膜压缩过程中形成的多层材料储库所必需的，结果导致暴露在空气中的单层在高度填充的DPPC富集区域中富集(图2)。这种相关膜的储库保持附着在界面膜上，并且还结合了新的到达表面活性剂复合物，提供稳定性，并允许材料在吸气过程中快速重新延伸到增加的表面积中。

疏水蛋白SP-B和SP-C是分泌时表面活性剂有效解包和表面膜形成所必需的。特别是在表面活性剂生物物理学中起着重要作用。这种属于皂甙元家族的蛋白质显示出脂膜融合和裂解活性，这归因于序列的不同片段。这些表面活性剂-B特性背后的脂质-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用是其促进表面活性剂有效吸附和再延伸以及在低表面张力下保持膜稳定性的原因。已知SP-B能够在膜之间产生接触，并且研究表明SP-B能够寡聚成由二聚体结合形成的环状结构，内部具有疏水空腔。SP-B低聚物的对接将允许连续表面活性剂结构的连接和疏水隧道的产生，脂质可以通过该隧道快速转移穿过肺泡流体相，吸附到界面膜上。由蛋白间相互作用提供的表面活性剂膜之间的粘附性对于支持膜的稳定性也很重要。除了提供一个疏水口袋，表面活性剂层表面的两亲性α-螺旋的定向允许蛋白质上带正电荷的残基与表面活性剂阴离子磷脂(主要是PG)的极性头静电相互作用。在文献中，有一些证据表明SP-B和SP-C与阴离子磷脂优先相互作用。这种PG/SP-B的相互作用对于蛋白质在膜中的定位可能是重要的。事实上，PG促进表面活性剂吸附和维持膜稳定性的作用，早期与它与阳离子疏水的相互作用有关蛋白质，特别是与SP-B。SP-B寡聚体形成蛋白脂质孔的可能性也意味着磷脂的参与，尤其是PG，是表面活性剂脂质转移/吸附特性的重要决定因素。除了聚乙二醇，不饱和磷脂也有利于表面活性剂的吸附，促进材料动态插入界面膜。另一方面，分子动力学模拟最近提出了SP-B与胆固醇的潜在选择性相互作用。

关于表面活性剂-碳，除了其促进表面活性剂吸附的含义外，它还被认为在维持表面活性剂储层与界面单层的附着方面发挥了作用，从而提供了稳定性。在表面活性剂的生物物理功能中，表面活性剂-B和表面活性剂-C之间的潜在合作可以从几项研究中推断出来，包括它们在表面活性剂的渗透性和脂质转移性质中的协同作用。事实上，与缺乏一种疏水性蛋白质的表面活性剂制剂相比，同时含有蛋白质(SP-B和SP-C)的表面活性剂制剂在促进呼吸方面表现出更好的功能特性。现已经提出了一个模型，其中SP-C也可以调节SP-B寡聚体之间的相互作用。这两种疏水蛋白的特定和相反作用是通过对脂囊泡的去稳定作用和对融合活性的去稳定作用来揭示的，并且可能在表面活性剂循环中具有功能意义。关于磷脂酰肌醇蛋白聚糖与脂质的优先相互作用，除了磷脂酰肌醇之外，蛋白质还被认为与胆固醇有特异性相互作用。这种中性脂质对于维持表面活性剂的适当流动性和粘度很重要，因此有利于膜的动力学性质。然而，表面活性剂中胆固醇的比例必须严格控制，因此其增加与功能抑制有关。在胆固醇存在的情况下，表面活性剂的存在似乎对确保表面活性剂的正常功能至关重要，并且表面活性剂-B和表面活性剂-C的联合作用对于在呼气时膜精制过程中去除胆固醇也是重要的。

尽管疏水蛋白是表面活性剂生物物理活性的主要参与者，但亲水蛋白对最佳功能也很重要。这种蛋白质形成由六个三聚体组成的寡聚体，能够通过其碳水化合物识别结构域结合DPPC和胆固醇(CRD)。SP-A诱导钙依赖性囊泡聚集和增强的表面吸附，需要一个超三聚体组装。蛋白质与胆固醇的相互作用可能涉及SP-A对中性脂质超生理浓度产生的表面活性剂功能障碍的保护作用。在由两个与SP-A相关的人类基因SP-A1和SP-A2编码的两种蛋白质中发现了略有不同的生物物理活性，这两种蛋白质在其结构的几个特征上有所不同。特别是，已证明SP-A1对于表面活性剂磷脂的有效吸附和在类似呼吸的压缩-膨胀循环中表面膜的重组是重要的。这种作用可能与SP-A1的高度低聚有关，这可能有助于形成高度内聚的多层膜，而SP-B对此至关重要。最近发现的SP-A和SP-B之间的蛋白质-蛋白质相互作用的存在也支持两种蛋白质在表面活性剂过程中的协同作用，一些证据甚至表明SP-A1和SP-A2与SP-B的不同相互作用模式的可能性，尽管仍然缺乏精确的信息。因此，蛋白质-蛋白质合作对于在不同水平的表面活性剂中发挥表面活性剂-A的生理作用至关重要，包括增强表面活性剂吸附、优化膜稳定性和允许在肺泡空间形成特定的表面活性剂结构，如管状髓鞘。

如前所述，表面活性剂膜对于降低表面张力、避免肺泡塌陷至关重要。因此，表面活性剂本身的存在是维持肺稳态、稳定肺泡和防止水肿形成的第一个不可或缺的要求。除此之外，表面活性剂排除了界面应力，界面应力可能会因AE2C与气液界面接触而变形并导致其功能障碍。表面活性剂在肺泡微观力学中的这种作用意味着其缺乏或功能障碍，无论是由原发性(如缺乏SP-B、AE2C损伤)还是继发性(如肺部炎症)原因引起的，都会引发肺损伤。

表面活性剂缺乏或改变与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的主要原因有关，ARDS是指经常与肺损伤相关的炎症过程。炎症本身介导AE2C损伤，但也释放促炎介质以及细胞和组织碎片，所有这些都有助于改变表面活性剂的组成。在急性呼吸窘迫综合征的肺泡间隙中发现了一组复杂的变化:表面活性剂脂质和蛋白质的量减少，表面活性剂蛋白质中间体和副产物的分布改变，产生表面活性剂抑制作用的血浆蛋白质水平增加(因为毛细血管通透性增加)，分泌型磷脂酶A2(PLA2)对表面活性剂的表面活性剂水解增加，以及活性氧物种的释放[[–]。缺乏特殊目的蛋白-C和特殊目的蛋白-A和特殊目的蛋白-B水平降低与家族性间质性肺病相关。在患有呼吸窘迫综合征(RDS)的新生儿和患有特发性肺纤维化、细菌性肺炎、慢性阻塞性肺病和哮喘的患者中也观察到了SP-A和/或SP-D水平的降低。

肺中肺聚集蛋白数量的减少会增加呼吸道感染的易感性，促进炎症并阻碍凋亡细胞的消除，从而导致异常的肺组织再生。老年人肺部的特殊蛋白-A水平降低的发现表明，衰老可能会加重表面活性剂缺乏的临床后果，特别是在慢性阻塞性肺疾病和特发性肺纤维化中。另一方面，由于肺聚集蛋白水平通常因蛋白质向血管室泄漏而降低，这些蛋白质的血清水平被认为是疾病严重程度的生物标志物和不利疾病结果的预测因素。

SP-B的遗传缺陷是罕见的，并且是导致SP-B或proSP-B蛋白缺失的突变的结果。这种疾病的特点是缺乏适当包装的板层体，缺乏成熟的蛋白多糖核酸和出现未加工的蛋白多糖核酸形式。除非SP-B生产的部分缺陷仍然允许SP-B的一定生产，否则这种遗传缺陷在出生时会导致致命的呼吸窘迫综合征，需要早期肺移植才能存活。因此，基因治疗将是逆转通常致命的SP-B缺陷的重要工具，最近在人类肺器官样物质的生产方面取得了有希望的进展。对于携带异基因突变的成年人，已经描述了成年人对肺部疾病的易感性，特别是在吸烟者中。与肺炎链球菌不同，遗传性肺炎链球菌缺乏通常不是新生儿呼吸窘迫综合征的原因，但间质性肺病，包括肺纤维化，可能会长期出现。由SP-C突变引起的疾病的病理生理学主要与AE2C细胞损伤有关，AE2C细胞损伤由内质网(ER)应激产生，归因于proSP-C错误折叠，或其向板层体的转运改变。另一方面，不同的研究表明，编码SP-A1和SP-A2的基因突变也与肺部疾病有关。例如，影响SP-A1(WR)或SP-A2(GV和FS)CRD结构域的突变分别与特发性间质性肺炎和肺纤维化相关。这些突变损害了蛋白质分泌，促进了内质网内的蛋白质聚集，增加了常驻AE2C的内质网应激。此外，已知肺聚集蛋白的遗传多态性与急性肺损伤，呼吸窘迫综合征和感染的易感性相关。在急性肺损伤的情况下，导致在SP-A1的胶原样结构域内插入或缺失三个氨基酸的多态性与该疾病的肺特征性水水平降低有关，这可能是由于蛋白质结构和结合特性的改变。编码所有表面活性蛋白的基因的单核苷酸多态性的复杂相互作用似乎导致了囊性纤维化患者的肺病。同样，SP-A1和SP-B多态性之间的相互作用与呼吸窘迫综合征的遗传易感性有关。

2.肺泡空间的表面活性剂稳态

2.1肺表面活性物质的合成、储存和分泌

宿主对脂多糖的反应主要由模式识别受体Toll样受体4介导(TLR4)。脂多糖激活TLR4需要脂多糖与几种受体近端蛋白的相互作用(图3)。脂多糖结合蛋白(LBP)结合脂多糖的聚集结构，并通过脂A结构域的特异性识别将脂多糖单体转移到分化簇14(CD14)的可溶性或膜结合形式。CD14随后将脂多糖转移到髓样分化因子2(MD2)，与TLR4形成复合物。脂多糖结合MD2在TLR4诱导构象变化，促进TLR4/MD2二聚化和随后CD14控制的TLR4内化入内体，启动信号级联。

表面活性剂蛋白-A，-C和-D已被证明在体外和体内均可作为脂多糖清除剂，有助于清除和灭活革兰氏阴性菌释放的脂多糖。这些蛋白质与不同的脂多糖相互作用。而SP-D分别与脂质A的酰基链以及核心和O-抗原的庚糖和甘露糖结合，SP-A只与脂质A结合。结果，SP-A只与粗糙的脂多糖结合，但已经表明，在缺乏这种阳离子的情况下，两种聚集蛋白都与再脂多糖结合。另一方面，SP-C通过其N末端片段与LPS的脂质A部分结合，可能是通过蛋白质的极性和碱性残基与脂质A二糖还原端带负电荷的1-磷酸末端基团之间的静电相互作用。类似地，SP-A与脂质A的1-磷酸结合可能涉及与位于蛋白质CRD的一簇碱性残基的静电相互作用。由于磷酸基团的负电荷是脂多糖结合LBP和激活TLR4/MD2复合物所必需的，所以SP-C和SP-A与1-磷酸的相互作用可能会屏蔽这一功能基团，阻断肺中对脂多糖的一些生理反应。这一假设得到了SP-A阻止再脂多糖与枸杞多糖相互作用的发现的支持。SP-A还在钙的存在下聚集粗糙的脂多糖聚集体，并重新排列脂多糖的聚集结构，该结构从倒置相变为层状相(图3)。脂多糖聚集体及其层状结构的聚集通过阻止脂多糖被脂多糖识别，以及随后脂多糖/CD14途径向炎症反应的启动，结构将降低脂多糖的毒性。

表面活性剂脂质可以促进表面活性剂蛋白质的清除作用。在这方面，已经表明脂多糖结合在修饰的猪肺表面活性物质的囊泡中和表面活性脂质膜中。光滑LPS和表面活性剂脂质之间的排斥相互作用促进了SP-A与光滑LPS的脂质A部分的相互作用，这导致了LPS分子的提取。此外，在表面活性剂膜中掺入脂多糖可以通过消除脂多糖与其细胞受体的相互作用来降低脂多糖的内毒素性。这一假设得到了早期研究的支持，早期研究报告称，当脂多糖掺入脂质体时，脂多糖的生物活性降低。或者，表面活性剂类脂可以结合到脂多糖聚集体中，改变脂多糖的聚集结构，从而降低其刺激免疫细胞的能力。

3.2与模式识别受体的相互作用

除了与脂多糖的直接相互作用之外，表面活性剂蛋白还通过与模式识别受体和相关分子的相互作用来调节细胞炎症反应。例如，SP-A通过结合CD14和TLR4/MD2复合物来调节细胞对平滑脂多糖的反应，尽管该脂多糖不是SP-A的配体。因此，甲状旁腺素和脂多糖受体之间的相互作用显著降低了光滑脂多糖的结合，从而阻止了光滑脂多糖诱导的细胞反应。相比之下，SP-A显著增强了粗脂多糖与CD14的结合，但没有减弱粗脂多糖与TLR4/MD2的结合。这种效应与形成一种SP-A/CD14/粗糙LPS复合物有关，其中SP-A的两亲性颈结构域将结合到CD14的富含亮氨酸区域，而CRD将结合到粗糙LPS的脂质A部分，允许LPS分子转移到TLR4/MD2复合物并启动针对病原体的生理反应。与CD14和脂多糖形成的三元复合物也被提出用于SP-C，与SP-A一样，它与CD14结合，增加了粗脂多糖的结合。在人胚肾HEKT细胞中，含磷脂囊泡的SP-C，而不是单独的脂质囊泡，通过TLR4依赖机制阻断脂多糖诱导的细胞因子产生。另一方面，SP-D通过其CRD与CD14和TLR4/MD2结合，降低了光滑和粗糙LPS与CD14[]和TLR4/MD2的结合。这表明SP-D可能作为一种负调节因子来保护免受由大量炎症介质的释放引起的慢性炎症状态的影响，这些炎症介质是SP-A和SP-C与粗糙的脂多糖及其受体相互作用的结果。

另一方面，阴离子表面活性剂脂质PG和PI通过与脂多糖受体的竞争性结合抑制脂多糖诱导的细胞活化。虽然磷脂酰肌醇干扰脂多糖和CD14之间的相互作用，但磷脂酰肌醇抑制脂多糖与LBP、CD14和MD2的结合。表面活性剂脂质可以通过将其结合到质膜中来防止TLR4被脂多糖激活。因此，DPPC已被证明能抑制TLR4向筏结构域的转移，排除脂筏中CD14和TLR4的共定位，而脂筏是脂多糖诱导TLR4活化所必需的。

4.抗菌效果

表面活性剂蛋白质和脂质也通过发挥抗菌作用促进肺稳态(图4)。SP-C和聚集蛋白缺乏的动物模型显示了宿主防御的显著缺陷，因为:(i)SP-C、SP-A和SP-D敲除小鼠更易受细菌、真菌和病毒感染，(ii)SP-A/-和SP-D/-小鼠显示这些微生物的摄取减少肺泡巨噬细胞(，以及(iii)通过气管内给予SP-A来恢复细菌清除。

肺聚集蛋白SP-A和SP-D通过直接结合多种微生物来防止微生物传播，包括病毒、真菌以及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。这些蛋白质识别微生物表面不同的病原体相关分子模式:革兰氏阴性菌中的LPS，革兰氏阳性菌中的脂磷壁酸和肽聚糖，分枝杆菌中的脂阿拉伯甘露聚糖，支原体中的磷脂，真菌中的葡聚糖和甘露糖，以及真菌和病毒中的糖蛋白。SP-A和-D与病原体的结合可能导致微生物聚集，这有助于呼吸道粘液纤毛清除，防止病原体附着在细胞表面，抑制微生物定居和入侵，并可能有利于微生物吞噬作用。SP-A和SP-D也作为调理素，增加微生物的结合、吸收和杀死。这需要与吞噬细胞上的不同受体特异性相互作用，如表面活性剂蛋白受体(SP-R)，SP-A的特异性受体，假定的调理素受体糖蛋白(gp)，巨噬细胞清除剂受体家族成员，与SP-A和SP-D都结合，或免疫球蛋白G。肺聚集蛋白球形头与病原体相关分子模式的相互作用促进胶原尾向吞噬细胞表面的钙网蛋白/分化簇91(CD91)的呈现，刺激吞噬作用和促炎反应。肺聚集蛋白还可以通过上调吞噬细胞中微生物识别所涉及的细胞表面受体的表达来刺激吞噬作用，如甘露糖受体或A类清道夫受体。肺聚集素可以通过调节补体系统来促进微生物清除。因此，SP-D通过形成C4b和C3b的额外结合位点来增强补体成分1q(C1q)的活性，这两种补体结合蛋白复合物参与调理作用。相反，SP-A与C1q的关联可能下调补体活性，防止C1q介导的补体激活和炎症。肺聚集蛋白也参与中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的病原体清除，NeTs是一种基于DNA的胞外陷阱，可捕获和杀死微生物。另一方面，由于脂多糖能有效地诱导神经网络的形成，最近研究表明，脂多糖与脂多糖的结合能减弱神经网络的形成。这表明SP-D可能调节蚊帐的抗微生物活性和加剧的免疫反应和组织损伤以及由肺部蚊帐过度存在引起的表面活性剂抑制之间的平衡。

SP-A和SP-D直接影响微生物的生长和生存能力。已发现肺聚集蛋白能抑制不同细菌的生长，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、嗜肺军团菌、鸟分枝杆菌和肺炎支原体。这种抑菌效果与SP-A和SP-D增加微生物细胞膜渗透性的能力有关。用粗糙脂多糖修饰的革兰氏阴性细菌菌株比含有光滑脂多糖的菌株更有效地被SP-A和SP-D透化。

结果RESULT

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